野生稻过氧化物酶分离纯化

导读:上海安亭科学仪器厂离心机在野生稻过氧化物酶分离纯化的过程中的应用，并检测POD的酶学特性，从而进一步研究野生稻抗逆生理尊定基础。

来源：未知发布日期：2019-12-20 10:59【大中小】

上海安亭科学仪器厂离心机在野生稻过氧化物酶分离纯化的过程中的应用，并检测POD的酶学特性，从而进一步研究野生稻抗逆生理尊定基础。

植物体内含有多种POD同工酶，其同工酶谱和酶的活性在不同组织器官和不同生长发育期内有较大变化，在植物生长、发育和逆境适应性反应中发挥重要作用。植物体内存在不同POD同工酶，POD表达和活性与植物的抗逆性密切相关。东乡野生稻是迄今为止世界上自然分布最北的冬天能越冬的野生稻，能耐受-8.5℃的极端低温，具有卓越的抗寒抗逆特性，是中国宝贵的野生稻种资源。笔者前期研究表明东乡野生稻POD的活性在不同发育时期和环境胁迫下存在着差异。为深入研究东乡野生稻过氧化物酶的功能和及其抗逆生理作用，本研究上海安亭科学仪器厂采用盐析沉淀、柱层析方法和活性电泳对东乡野生稻的过氧化物酶进行纯化和鉴定，并检测POD的酶学特性，从而为进一步研究东乡野生稻抗逆生理奠定基础。

1主要试验仪器
UV2600紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；CR22GⅡ型高速冷冻离心机（Himac，日本）；JA5003上皿电子天平（上海精科天平）；TGL-16G台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；DYY-12型电脑三恒多用电泳仪（北京六一仪器）；多功能直射凝胶电泳系统（BIO-RAD）；核酸蛋白检测仪HD21C-B（上海康华生化仪器制造厂）；TH-500A梯度混合器（上海沪西分析仪器厂）；LM17型色谱记录仪（永青示波器厂）

2.POD分离纯化
（1）粗酶原液制备将所取水稻叶片用蒸馏水洗净、滤纸拭干、称重、剪碎后，置于预先冰浴冷却的小研钵中，按照W/V=1:2比例加入酶提取液（40mmol/LpH6.0磷酸缓冲液）。冰浴研磨成匀浆后，4层纱布过滤，10000r/min离心20min，取上清液，上清液即为粗酶液，放入4℃冰箱中备用。

（2）粗酶原液的硫酸铵盐析与透析采用硫酸铵(NH4)2SO4分级沉淀法提取POD酶，粗酶液中缓缓加入硫酸铵使其达到20%的饱和度，同时轻轻搅拌，4℃条件下静置一段时间后，10000r/min离心20min，收集沉淀，加入少量提取缓冲液溶解沉淀备用。重复上述步骤，继续加入硫酸铵，使得样品液中的硫酸铵饱和度依次达到40%、50%、60%、70%和80%时，分别收集沉淀，用等体积提取缓冲液溶解沉淀。各样品液进行透析脱盐处理，测定蛋白含量和POD酶活力，计算比活力，从而确定沉淀提取POD酶的合适初始分级硫酸铵饱和度，然后依据合适的初始硫酸铵饱和度批量提取粗POD蛋白。

3讨论与结论
综上所述，本文上海安亭科学仪器厂以东乡野生稻叶片组织为材料，通过浸提、硫酸铵盐析、透析和SephadexG-100凝胶柱层析等系列步骤，分离得到POD1同工酶，其比活力为568.80U/mg，POD酶蛋白的纯化倍数为16.49。聚丙烯凝胶活性电泳检测表明，纯化得到了单一组分的东乡野生稻POD酶蛋白。经测定，POD酶Km为1.26mmol/(L·min)，最大反应速度Vmax为17.51mmol/(L·min)，最适宜的pH5.0，最适宜温度35℃~45℃，Cu2+和Zn2+对POD有较强的激活作用，而Fe3+对POD活性有一定的抑制作用，POD酶活性受甲醇、乙醇和丙酮等有机试剂抑制。研究表明，过氧化物酶与植物生长密切相关，过氧化物酶是植物体内活性氧酶促防御系统的关键酶之一，在生物胁迫和非生物胁迫条件下均发挥作用，前期工作也发现东乡野生稻体内过氧化物酶的活性随着生育期不同而发生变化，本研究进一步纯化了东乡野生稻POD酶并研究了酶的催化特性，为深入探讨其在体内生理功能奠定了基础。

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